【2.2】Fastq格式--phred33/64
Fastq格式里的reads质量得分编码方式有好几种，现在Illumina用的一般是Phred33，但偶尔还会遇到Phred64（旧版本）的。附件里的perl脚本可以把质量得分以数字的形式打印出来，并帮助判断是Fastq32格式还是Phred64。
FASTQ是基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式。一般由测序下级文件bcl得来，其序列以及质量信息都是使用一个ASCII字符标示，最初由Sanger开发，目的是将FASTA序列与质量数据放到一起，目前已经成为高通量测序结果的事实标准。
一、文件的命名
fastq文件一般遵循这样的命令规程
__L_R_.fastq.gz
例如：
NA10831_ATCACG_L002_R1_001.fastq.gz
二、文件的格式
FASTQ格式的序列一般都包含有四行:
- 第一行由'@‘开始，后面跟着序列的描述信息，这点跟FASTA格式是一样的。
- 第二行是序列
- 第三行由’+‘开始，后面也可以跟着序列的描述信息
- 第四行是第二行序列的质量评价**（quality values，注：应该是测序的质量评价），字符数跟第二行的序列是相等的。
例子：
@FCC0U6BACXX:6:1101:1418:2067#CTAGTTAT/1
CCGGTAAAGGATCGTATCCTGCGTGCACGATGGCGGTATTTGCGCTGGATACACCCATCCCAATATCAGCTGCTTTATCGATCAACAAGA
+
abbecceegggggiihhhfgihiifhhiihiiiihiZafgffhihg]aabdedddcab^ac`bcbb_]`bcccR]SSYSWQ[JT]`_^X[
2.1 第一行（ Sequence identifier）
@<instrument>:<run number>:<flowcell ID>:<lane>:<tile>:<x-pos>:<y-pos> <read>:<is filtered>:<control number>:<index sequence>
每个元素的意思如下：
| Element | Requirements | Description |
|---|---|---|
| @ | @ | Each sequence identifier line starts with @ |
| < instrument> | Characters allowed: a-z, A-Z, 0-9 and underscore | Instrument ID |
| < run number> | Numerical | Run number on instrument |
| < flowcell ID> | Characters allowed: a-z, A-Z, 0-9 | - |
| < lane> | Numerical | Lane number |
| < tile> | Numerical | Tile number |
| < x_pos> | Numerical | X coordinate of cluster |
| < y_pos> | Numerical | Y coordinate of cluster |
| < read> | Numerical | Read number. 1 can be single read or read 2 of paired-end |
| < is filtered> | Y or N | Y if the read is filtered, N otherwise |
| < control number> | Numerical | 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number. See below. |
| < index sequence> | ACTG | Index sequence |
关于control number
The tenth columns (
- Bit 0: always empty (0)
- Bit 1: was the read identified as a control?
- Bit 2: was the match ambiguous?
- Bit 3: did the read match the phiX tag?
- Bit 4: did the read align to match the phiX tag?
- Bit 5: did the read match the control index sequence?
- Bits 6,7: reserved for future use
- Bits 8..15: the report key for the matched record in the controls.fasta file (specified by the REPORT_KEY metadata)
2.2 关于质量编码格式
质量评分指的是一个碱基的错误概率的对数值。其最初在Phred拼接软件中定义与使用，其后在许多软件中得到使用。其质量得分与错误概率的对应关系见下表：
Phred quality scores are logarithmically linked to error probabilities
PHRED QUALITY SCORE PROBABILITY OF INCORRECT BASE CALL BASE CALL ACCURACY
10 1 in 10 90 %
20 1 in 100 99 %
30 1 in 1000 99.9 %
40 1 in 10000 99.99 %
50 1 in 100000 99.999 %
Phred quality scores Q are defined as a property which is logarithmically related to the base-calling error probabilities P.
Q=-10log10P
对于每个碱基的质量编码标示，不同的软件采用不同的方案，目前有5种方案：
Sanger，Phred quality score，值的范围从0到92，对应的ASCII码从33到126，但是对于测序数据（raw read data）质量得分通常小于60，序列拼接或者mapping可能用到更大的分数。
Solexa/Illumina 1.0, Solexa/Illumina quality score，值的范围从-5到63，对应的ASCII码从59到126，对于测序数据，得分一般在-5到40之间；
Illumina 1.3+，Phred quality score，值的范围从0到62对应的ASCII码从64到126，低于测序数据，得分在0到40之间；
Illumina 1.5+，Phred quality score，但是0到2作为另外的标示，详见http://solexaqa.sourceforge.net/questions.htm#illumina
Illumina 1.8+
最重要的是通过下面的这个脚本，我知道了我的测序采用的是phred64这个编码。
参考资料
