【5.1.1】Kallisto原理及应用

一、Kallisto简介

首先，这款软件是2016年发表在NBT上的一款RNA-seq的计数软件，文章标题为《Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification》（http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3519） 这款软件对比TopHat+cufflinks，Hisat+HTseq等流程组合，就时间上要快很多。 而该软件的核心思想是省略了将原始数据fastq文件比对到擦靠基因组上，然后再计数这一过程，取而代之的是直接将fq文件的reads比对参考转录组上并且直接计数

1.1 Kallisto算法

该算法认为，将fq文件的reads比对到参考基因组的具体位置，然后根据位置信息进行计数数没有实质性意义的，而该算法采用的是伪比对的方式：即直接将fq文件的reads比对参考转录组上并且直接计数

首先，作者先要根据参考转录组建立索引，即可哈希的关系。 然后，作者利用k-mer基于德布鲁因图的方法将fq文件的reads比对到参考转录本上，并且确定哪些k-mer属于哪一个转录本

如上图所示，黑色部分表示fq文件的reads，而彩色部分表示具有overlap的转录本的外显子部分 然后利用k-mer根据德布鲁因图将fq文件的reads比对到这些转录本上去

那么上图黑色部分（fq文件reads的前半部分）主要比对到了红色和蓝色这两个转录本上面，图C fq文件reads的前半部分

而白色部分（fq文件reads的后半部分）主要比对到了红色，蓝色和绿色这三个转录本上面，图C fq文件reads的后半部分

那么基于上述结果，我们取一个交集：

那么，该条reads就计数为红，蓝这两个转录本上了，该软件就利用这个原理进行计数，就省去了比对到参考基因组上这一过程

二、Kallisto具体应用

首先建立参考转录本的索引：

kallisto index -i refMrna.idx refMrna.fa

计数

#单端
kallisto quant -i transcripts.idx -o output -b 100 --single -l 180 -s 20 fastq

#双端
kallisto quant -i refMrna.idx -o output -t 8 -b 100 fastq_1 fastq_2

三、我的案例

git clone https://github.com/pachterlab/kallisto
cd kallisto
mkdir build
cd build
cmake ..
make
make install

cd /data4/aNEO_data/mice/Mus_musculus/UCSC/mm10/Sequence/Chromosomes/
kallisto index -i ref_mm10.idx ref_mm10.fasta



kallisto quant -i index -t 120 -o output pairA_1.fastq pairA_2.fastq

参考资料

• https://www.jianshu.com/p/0e5dfdf56034
• https://www.jianshu.com/p/5828d1d060aa
• 《Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification》（http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3519）
• https://pachterlab.github.io/kallisto/manual