表达量计算--RPKM, FPKM, TPM，CPM，RPM
两类测序bias：
- 长度bias：相同表达丰度的转录本，往往会由于其基因长度上的差异，导致测序获得的Read（Fregment）数不同。总的来说，越长的转录本，测得的Read（Fregment）数越多。
- 测序深度bias：由测序文库的不同大小而引来的差异。即同一个转录本，其测序深度越深，通过测序获得的Read（Fregment）数就越多。
本文提到的RPKM/FPKM/RPM等方法都是为了消除这两类bias而进行的标准化。例如：RPM主要应用于sRNA（sRNA长度变化不大），来消除测序深度bias；RPKM/FPKM应用范围会更广泛，用于同时消除长度及测序深度这两种bias。
一、几种丰度计算方法
1.1 reads Count
- 定义：高通量测序中比对到exon上的reads数。可使用featureCount等软件进行计算。
- 优点：可有效说明该区域是否真的有表达及真实的表达丰度。能够近似呈现真实的表达情况。有利于实验验证。
- 缺点：由于exon长度不同，难以进行不同exon丰度比较；由于测序总数不同，难以对不同测序样本间进行比较。
1.2 RPKM
RPKM：Reads Per Kilobase Million=Reads Per Kilobase Per Million Reads，即每一百万条Reads中，对基因的每1000个Base而言，比对到该1000个base的Reads数。
$ \frac{R1*10{}^{9}}{L1*RT} $
R1=map到该基因的reads总数
L1=该基因长度
RT=map到基因组的总reads数
1.3 FPKM
FPKM：Fragments Per Kilobase Million=Fragments Per Kilobase Per Million Reads。
$ \frac{F1*10{}^{9}}{L1*FT} $
F1=map到该基因的fragments总数
L1=该基因长度
FT=map到基因组的总fragments数
FPKM意义与RPKM的区别仅在于，Fragment 与 Read。
RPKM的诞生是针对早期的SE测序，FPKM则是在PE测序上对RPKM的校正。
Reads即是指下机后fastq数据中的每一条Reads，Fragments则是指每一段用于测序的核酸片段，在SE中，一个Fragments只测一条Reads，所以，Reads数与Fragments数目相等；在PE中，一个Fragments测两端，会得到2条Reads，但由于后期质量或比对的过滤，有可能一个Fragments的2条Reads最后只有一条进入最后的表达量分析。总之，对某一对Reads而言，这2条Reads只能算一个Fragments，所以，Fragment的最终数目是Reads的1到2倍之间。
1.4 RPM
- 定义：RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)
- 公式：RPM = ExonMappedReads * 10^6 /TotalMappedReads
优点：利于进行样本间比较。根据比对到基因组上的总reads count，进行标准化。即：不论比对到基因组上的总reads count是多少，都将总reads count标准化为10^6。sRNA_seq等测序长度较短的高通量测序经常采用RPM进行标准化，因为sRNA长度差异较小，18-35 nt较多，所以长度对不同的small RNAs相互比较影响较小 (优点：计算简单、方便。)。
缺点：未消除exon长度造成的表达差异，难以进行样本内exon差异表达的比较。
1.5 TPM
TPM：Transcripts Per Million。
TPM的计算分3步：
- step1：根据基因/转录本长度校正count值；假设某基因count值为R1，则校正后count值为：R1/(L1/1000) ==> L1为该基因的长度；
- step2：计算total 校正后count值；即所有基因的校正后count值总和，Rtotal；
- step3：计算TPM；TPM结果为：
$ \frac{R1*10{}^{9}}{L1*Rtotal} $
优点：首先消除exon长度造成的差异，随后消除样本间测序总reads count不同造成的差异。
缺点：因为不是采用比对到基因组上的总reads count，所以特殊情况下不够准确。例如：某突变体对exon造成整体影响时，难以找出差异。
二、相互关系
评价：以上几种计算exon表达丰度的方法，差异不是非常大。如果结果是显著的，那么采用上面任一计算方法大多均可找出显著结果。但是当表达丰度差异不是那么显著时，不易区分不同类别，需要根据实际需要选择对应的标准化方法。通常情况下首先推荐FPKM值；计算样本差异时(edgeR/DESeq2等)，采用raw read count；计算sRNA丰度时，通常采用RPM值。
注意：以上TotalMappedReads推荐首选比对到基因组上的总reads数，而不是比对到exon或者gene上总reads数。而且需要注意可能存在某一区域产生大量序列的情况，如：rRNA/tRNA及一些未注释区域等。如果该区域可能影响最终结果，TotalMappedReads需要减去这些产生过量扩增的序列或去除重复序列（Deduplicate很多时候都是很有必要的，samtools markdup：bam文件过滤和去重复）。这同样需要根据实际情况而定。
参考资料
