【9.1.3】mRNA共转录加帽技术
但是，在细胞核内以DNA模板生成的是premature的RNA，需要在细胞核内进行一系列后转录的修饰，生成成熟的mRNA，转移到细胞质内进行后续的翻译过程，形成相应的蛋白。
后转录修饰是非常复杂的过程，包括几种酶的应用。下图大体描述了这一过程的变化。
mRNA疫苗和药物因为具备安全性高、免疫性好、开发周期短以及量产迅速等优势，已经逐步应用到传染病疫苗、肿瘤细胞治疗、罕见病治疗、蛋白代替疗法等领域。
一、mRNA的结构
在真核细胞中，成熟的mRNA具备一些关键的结构元件来发挥相关的功能。而体外转录的mRNA，则是通过模拟内源性mRNA的结构来发挥作用。
成熟mRNA的结构主要有五个部分，从5' 到3' 包括：5' 帽子结构（5' cap）、5' 非翻译区（5' UTR）、编码抗原的开放阅读框、3' 非翻译区（3' UTR）和一个PolyA尾。
新冠mRNA疫苗快速研发、生产和批准，使世界对mRNA有了更深入的认识。当前有很多研究正在开展，不仅是疫苗、药物应用上，也涉及各种细胞治疗、基因治疗方面，验证着mRNA的潜力。
而想要实现这些突破，帽子结构（cap）对于mRNA来说至关重要。
5' 帽子结构包含一个7-甲基鸟苷核苷。现有研究发现，5' 端帽子结构可以调节mRNA的剪切成熟，并帮助RNA转录产物穿过核膜的选择性孔道而进入细胞质。
此外，5' 帽子结构还可以保护mRNA不被核酸外切酶降解，与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。
抗原编码区两侧的5' UTR、3' UTR和PolyA尾的长度，则可以调节mRNA翻译和半衰期。
mRNA疫苗和药物的开放阅读框，是实现功能的关键组成部分。这部分通过密码子优化，在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。在转录过程中，该部分加入假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物，这些修饰核苷酸的引入阻止了模式识别受体的识别，确保翻译过程产生足够的蛋白质。
分别来自Moderna和Pfizer/BioNTech的两款新冠mRNA疫苗，都含有前述的核苷修饰。
二、真核生物mRNA帽子结构
帽子结构是指在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5’端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶、mRNA鸟苷酰转移酶、mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶和mRNA（核苷-2' ）甲基转移酶催化形成的。
根据甲基化程度不同，在自然界的mRNA可形成3种类型的帽子：Cap 0、Cap 1和Cap 2。
鸟苷以5'-5' 焦磷酸键与初级转录本的5' 端相连。当G第7位碳原子被甲基化形成m7GPPPN时，此时的帽子称为“Cap 0”，它存在于单细胞中。
如果转录本的第一个核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m7GPPPNm，称为“Cap 1”，除了单细胞生物外，这是一种多数的帽子形式。
换言之，Cap 0和Cap 1的主要区别，在于第一个核苷酸的2'-O位羟基是否被甲基化。甲基化具有非常重要的活性和功能，可以提高mRNA在体内表达量，同时帮助mRNA逃脱体内免疫系统识别，更好地稳定mRNA结构。
如果转录本的第一、二个核苷酸的2'-O位均甲基化，成为m7G-PPPNmNm，则称为“Cap2”。10%-15%真核细胞中存在Cap 2，但它的作⽤在很⼤程度上尚未得到探索。
真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。而mRNA想要成为一种大规模的商业化产品，体外转录环节尤其关键。
mRNA疫苗或者药物需要形成Cap 1结构，才能在体内稳定表达。
三、mRNA加帽的方法
在体外转录、制备mRNA有不同的方法，包括酶加帽、共转录加帽等。
- 酶法加帽 成本相对较低，但是多了加帽和甲基化步骤，引入了两个额外的蛋白和SAM，工艺步骤变繁琐，增添QC检测项。
- 共转录加帽 一步到位，合成结束，可直接纯化，缺点是 Cap analogs 成本昂贵。考虑到未来随着技术的不断进步，帽子类似物合成方式取得新突破，成本必将发生大幅下降，因此共转录加帽必然成为未来mRNA合成的绝对主流。
3.1 酶加帽
这种方法最为传统，通过dsDNA作为底物，经过转录形成RNA，再经后续修饰成为mature的RNA。
这方面有一个发现值得关注。利用牛痘病毒加帽酶（VCE, Vaccinia caping enzyme）和二氧甲基转移酶（2’O-methyltransferase），可以实现天然未修饰的帽结构。
这种方法几乎可以达到100%的加帽率，问题在于，牛痘病毒加帽酶比较昂贵，需要的酶促成本高（T7聚合酶、无机焦磷酸酶、DNA酶I），批量生产成本高。另外，引入了额外的蛋白和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），工艺流程繁琐，需多次纯化，增加了QA/QC检测项。
3.2 共转录加帽
利用帽类似物直接进行体外转录生成带帽结构的mRNA，工艺流程简便，迅速提升mRNA疫苗和药物的产能。
基于化学合成工艺的发展，帽类似物的结构已经从最开始第一代的mCap逐步发展到第二代的ARCA和第三代Cap 1类似物（CleanCap）。
第一代帽类似物mCap，标准帽结构类似物由于存在两个游离的3'-OH部分，m7Gppp G能够以两种方向整合m7G（5' ）pppG-RNA或G（5‘）pppm7G-RNA，产生转录本为5' -加帽和5' -三磷酸的混合转录产物。
帽类似物以错误的方向掺入形成的反向帽结构与eIF4E结合很差，mRNA则无法有效翻译，从而导致目标蛋白产量低。
ARCA（抗反向帽类似物）是第二代帽类似物。因为ARCA在第三位进行了甲氧基的修饰，只有一个3'-OH基团，进行共转录时为定向整合，因此转录过程中只能以正确的方向插入，所形成的mRNA被翻译时的效率相当于mCap形成的mRNA的两倍。
在转录反应中，使用ARCA与GTP的4:1混合物将得到约70%的加帽mRNA。ARCA共转录生成Cap 0结构的mRNA，1μg起始模板量大约转录产生~30μg mRNA产物，转录产量低，并且需要二氧甲基转移酶进一步作用生成Cap1结构的mRNA。
第三代Cap1类似物（CleanCap）共转录直接生成Cap1结构的mRNA，1μg起始模板量大约转录产生80-100μg mRNA产量高，加帽效率提高到90%以上。
第三代方法解决了ARCA产量低和加帽效率低的问题。BioNTech上市的新冠疫苗BNT162b2采用共转录加帽工艺。
不过，由于这种技术涉及高昂的专利费，业界也亟需能够避开专利实现共转录加帽的新方法。需要考量的因素包括：高效转录过程具有较高的mRNA加帽率；能被eIF4E复合体识别，转录率高；mRNA稳定性好；易于扩大规模和成本效益等。
迄今为止，也有很多的研究聚焦在帽结构的化学修饰上，通过在帽结构的不同位置进行不同的修饰改造，可以增加mRNA的表达量。
参考资料
